布莱恩·威廉·琼斯，罗伯特·马克和丽贝卡·l·法伊弗gydF4y2Ba
1.简介gydF4y2Ba
视网膜变性和重构包括一组在分子、细胞和组织水平上的病理，它们是由遗传性视网膜疾病如色素性视网膜炎(RP)、遗传和环境疾病如视网膜色素变性(RP)引起的gydF4y2Ba老年性黄斑变性gydF4y2Ba其他对眼睛/视网膜的侮辱包括gydF4y2Ba外伤及视网膜脱离gydF4y2Ba．这些视网膜变化和明显的可塑性导致神经元重新连接和重新编程事件，包括基因表达的改变，gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba神经细胞的形成以及新突触的形成，通过树突树的改变和额外的轴突生长，在双极细胞中产生腐蚀回路。此外，神经元迁移发生在视网膜垂直轴上的Müller细胞柱，显示代谢信号改变，和gydF4y2Babeplay2018官网 (RPE)侵入视网膜形成色素骨针已成为RP疾病的经典临床观察。gydF4y2Ba
视网膜光感受器驱动神经视网膜中的信号处理网络，包括双极细胞、水平细胞、无分泌细胞和神经节细胞。历史上一直认为视网膜退行性疾病，如RP影响感觉视网膜，使神经视网膜相对未受损。这是不正确的，因为输入到神经视网膜的杆和锥的损失构成了传入阻滞，在细胞和分子水平上的重建成为不可避免的(1-23)。gydF4y2Ba
视网膜退行性疾病有许多潜在的起始事件，由自然发生的疾病过程(24)、视网膜脱离(25,26)等创伤或任何形式的色素性视网膜炎(5,24,27,28)引起，但无论原因如何，如果光感受器，特别是视锥细胞丢失，就会启动一系列进展事件，诱导神经视网膜的负性可塑性重构(9- 11,14 - 16,20,23,29)。基本上，每一种导致光感受器丧失的疾病过程都会引发视网膜重构，作为最终的共同途径，最终导致细胞死亡和视网膜拓扑结构重构。视网膜重构的进展与发生在中枢神经系统疾病(如创伤和癫痫)中的负可塑性相似，并构成了所有类型的救援策略的实质性障碍。gydF4y2Ba
2.视网膜重构的阶段gydF4y2Ba
视网膜重构分阶段发生:在第一阶段，光感受器应激启动早期重构和重编程事件。在第二阶段，小胶质细胞，Müller胶质细胞和RPE细胞参与。当Müller细胞开始将视网膜与脉络膜隔离时，外核层(ONL)变薄/消融发生，细胞应激通路参与。在第三阶段，新生神经突的形成、重新连接和神经元死亡开始了一个随着神经元易位和视网膜大规模拓扑结构重组继续进行的过程。我们将在本章中说明，迄今为止检查的所有视网膜退行性疾病，包括自然、人工和诱导模型，都在一定程度上显示了重构，负可塑性的严重程度取决于侮辱的连贯性和视锥细胞是否存活。此外，早期视网膜重构通常是临床上隐匿的，发生在任何显著的临床眼底镜成像之前。gydF4y2Ba
3.老年性黄斑变性gydF4y2Ba
与正常视网膜相比(图1)，AMD表现出另一组临床表现，包括眼底镜下的黄斑或黄斑，以及干性AMD中可见的脉络膜视网膜萎缩区域，也称为地理萎缩(GA)(图2)。可以看到GA在6年期间的进展动画gydF4y2Ba在这里gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
AMD的组织学表现为干性AMD的drusen发展，似乎诱导感光细胞应激和损失(30)。湿性AMD是另一种完全导致光感受器死亡的疾病过程，由于血管发育和血液和血清渗漏到神经视网膜。这种视网膜下血也会导致gydF4y2BaRPE脱离可能有其自身的视网膜退行性机制gydF4y2Ba以及视网膜直接死亡。gydF4y2Ba
临床上，干性AMD患者经常抱怨在夜间或黑暗环境中看东西困难，需要更明亮的灯光来工作。他们报告说，在他们的视觉中心部分，颜色饱和度下降，印刷文字或图像模糊度增加。随着退化过程的进展，视力缺陷会继续发展，直到中心视野出现扭曲，最终失明。gydF4y2Ba
虽然本章的大部分讨论将集中在色变性视网膜炎(RP)上，但应该注意的是，上面讨论的视网膜重构的终末阶段以及下面将详细阐述的可塑性和重构也发生在AMD中，特别是干性AMD(30)。gydF4y2Ba
图2。人视网膜黄斑变性中典型drusen的眼底图像。gydF4y2BaAMD还表现出另一组临床表现，包括眼底黄斑或黄斑，以及干性AMD中可见的脉络膜视网膜萎缩区，也称为地理萎缩(GA)。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba在这里可以看到GA在6年的进展动画gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图3。人眼中晚期RP的眼底图像gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
4.视网膜色素变性(RP)gydF4y2Ba
RP是一种进行性神经退行性疾病，通常从视网膜外围开始发展到视网膜中心。有许多不同形式的RP，其起始病因各不相同，包括视网膜色素上皮缺陷、视紫红质加工和运输缺陷、视紫红质堆积缺陷、纤毛缺陷等。然而，一般来说，RP分为3大类，包括杆状变性、杆状/锥状混合变性和碎片相关的形式gydF4y2BamertkgydF4y2Ba白化小鼠/大鼠的光损伤模型等缺陷和模型。不管最初的伤害如何，最终的结果都是一样的:光感受器承受压力和随后的细胞死亡，这有效地阻断了神经视网膜的传入，导致神经重塑事件，改变了神经视网膜的拓扑结构和回路。gydF4y2Ba
临床后遗症取决于所涉及的RP的广泛类别。最初，杆状/锥体营养不良表现为从青少年或20岁出头开始的夜盲症。的变化gydF4y2Ba网膜电图(ERG)gydF4y2Ba通常可以在眼底镜发现之前观察到，最显著的是在RP的x -联型中，杆状细胞开始承受压力和细胞死亡。这揭示了一个基本的发现:光感受器的功能在光感受器细胞死亡之前被改变或受损，组织学上的重大改变变得明显。在早期退化视网膜中使用1-氨基-4胍丁烷或胍丁胺(AGB)进行谷氨酸通道渗透研究，通过记录双极细胞群丢失前双极细胞亚群和谷氨酸通道表达的改变，也支持了这一发现(23,31)。gydF4y2Ba
当这张经典的眼底镜图像(图3)出现时，视网膜变性已经进展，许多细胞群已经显著改变或丢失，Müller细胞变得肥大，充当神经元易位以及色素从RPE易位到视网膜内部的高速公路(23,31)。gydF4y2Ba
色素性视网膜炎中的色素骨针是RPE中色素颗粒的积累，这些颗粒被凝聚成带状和块状并向下拉入神经视网膜。图4是一个背光放大的地球仪和完整的视网膜图像gydF4y2Ba集中堆放gydF4y2Ba为了说明在一个完整的球中着色的骨针的结构。gydF4y2Ba
当你考虑着色骨针是如何形成的，视网膜中其他类型细胞的状态就成了一个问题。在RP的高级病例中尤其如此，我们将在本章末尾讨论仿生和生物干预。视觉科学研究视网膜退行性疾病的组织学已经有一段时间了，有很多描述，但不知何故，一些重要的特征被忽略了，或者只是简单地讨论了一下，然后就被遗忘了。gydF4y2BaJaissle等人在2010年gydF4y2Ba(32)观察了在视紫红质敲除小鼠模型rho-/-中着色骨针的形成过程，得出RPE色素颗粒沿血管迁移的结论。然而，我们现在知道Müller细胞作为迁移的导管，不仅在rho-/-中可见，而且在许多其他模型中也可见。gydF4y2Ba
考虑gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba视网膜拓扑结构的明显变化在RP晚期表现出来，视网膜中所有单个细胞类别的状况以及它们的连通性都成了问题。如果你对构成视网膜的细胞类型进行统计，你会发现在退化的视网膜中，多达82-84种细胞会以不同的方式受到影响。名义上，我们有1个运输上皮类，即RPE, 3个由2个锥状光受体类和1个杆状光受体类组成的光受体细胞类，2个胶质细胞类:Müller细胞和星形胶质细胞，2个水平细胞类(图5中小鼠眼的1个水平细胞类)，2个血管细胞类，35个无分泌或关联细胞类，10个双极细胞类，1个免疫细胞类和18-20个神经节细胞类(33)。gydF4y2Ba
图5。野生型小鼠视网膜甲苯胺蓝染色。gydF4y2Ba感光层在上，神经节细胞层在下。gydF4y2Ba
5.历史组织学方法gydF4y2Ba
传统的组织学准备gydF4y2Ba甲苯胺蓝gydF4y2Ba在图5和图6中是很多文献中常见的它们让我们能够很容易地区分层数并计算感光细胞的数量或层数这是衡量视网膜完整性水平的传统方法。这些测量为我们提供了形态描述符，并为退化程度提供了一些度量。gydF4y2Ba
事实证明，这种类型的组织学虽然提供了惊人的信息，但在过去的几年里，让我们视觉界陷入了一些麻烦。检查图6似乎显示了一层较薄的外核层，被描述为部分厚度，但视网膜的其他部分，至少在这里，看起来还可以，这导致许多人对神经视网膜的完好程度做出了假设。当视网膜拯救的讨论出现时，以及随后设计的干预和治疗失明的策略，都是基于对视网膜完整性的假设知识水平，来拯救视力。gydF4y2Ba
图6。光损伤白化病小鼠视网膜的甲苯胺蓝染色。gydF4y2Ba光感受器层在上面，神经节细胞层在下面。gydF4y2Ba
6.视网膜的可塑性gydF4y2Ba
当然，视网膜是神经组织，在中枢神经系统(CNS)或视网膜的可塑性并不是一个新概念。我们很早以前就知道，发育中的视网膜具有高度的可塑性。这种认识可以追溯到1933年gydF4y2Ba·拉蒙-卡哈尔gydF4y2Ba在他优雅的插图高尔基色斑形成的视网膜，如图7所示。(34)。gydF4y2Ba
图7。Ramón y Cajal 1933年的视网膜发育插图gydF4y2Ba(34)。gydF4y2Ba
另一个视网膜可塑性发育的经典例子是由1978年的Hinds和Hinds(35)(图8)用一个优雅的序列切片研究说明的，该研究显示从胚胎第13天到第17天无分泌细胞神经突发育。Hinds和Hinds还探索了E15之前细胞起源的放射自显影研究。有趣的是，Hinds和Hinds也证实了Cajal在45年前观察到的发育中的外心室层双极型无侧分泌细胞。gydF4y2Ba
图8。从母鹿和母鹿的一系列EM研究中提出的无分泌细胞神经突发育序列gydF4y2Ba, 1978年。gydF4y2Ba(35)。gydF4y2Ba
在过去的40年里，许多关于视网膜发育的研究表明，不同类型的视网膜细胞是如何发育的，并经历各种形态和在视网膜中的迁移，最终到达它们成熟的视网膜位置，并参与神经回路。细胞与其他细胞的相互作用和突触回路的建立通常与药物、光和模式刺激有关，这导致了视网膜的成熟。参见Webvision by中的章节gydF4y2Ba宁添gydF4y2Ba，gydF4y2Ba瑞秋黄gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba马拉樵夫gydF4y2Ba关于视网膜组织的这些发育阶段。所有这些研究都确凿地表明，发育中的视网膜具有很强的可塑性。然而，人们认为成人的视网膜在形成后或多或少地保持着硬连接。gydF4y2Ba
对非哺乳动物物种的研究提供了一些线索，表明事实并非如此。众所周知，鱼在一生中都会在视网膜上增加视杆感光器和一些次生视网膜中间神经元(36-38)。此外，当眼睛受损时，两栖动物可以再生一个完整的视网膜，甚至视网膜和大脑之间的连接(39)。亚哺乳动物视网膜可塑性的一个更微妙的例子被展示出来，同样是在鱼身上，仅仅是对每日的明暗循环的反应。例如，在鱼的视网膜上，视网膜色素上皮细胞在明暗状态下都有视网膜运动(40)。此外，有证据表明，在成年鱼视网膜的感光突触中，水平细胞的突触具有神经可塑性，棘突根据光照条件来来回回(参见网络视觉中水平细胞一章)。此外，内丛状层的双极突触显示突触装置，即突触带，随着光和暗的适应而出现和消失(图9)(41)。gydF4y2Ba
图9。双极端子(bi)内丛状层gydF4y2BaNannacaragydF4y2Ba视网膜(cyclid鱼)。gydF4y2BaA，在适应光的动物中，带突触具有两个突触后元件，即神经节或无分泌细胞突(x)。注意突触带的五胺酸结构(s.r)。B，在适应黑暗的鱼类中，两侧有五个突触突的双极性末端(x)。它不包含任何条带。Os-EPTA;放大x 48000。gydF4y2Ba来自瓦格纳，1973(41)。gydF4y2Ba
但是鱼的视网膜比哺乳动物更复杂，因为与哺乳动物相比，视网膜上进行了大量的视觉信息处理，而哺乳动物的大脑中进行了相同的视觉处理(道林最初的概念是简单哺乳动物视网膜与非哺乳动物复杂视网膜的对比，42)。所以可塑性的问题gydF4y2Ba成人gydF4y2Ba正常的哺乳动物视网膜直到最近才被建立起来。gydF4y2Ba
然而在1984年，Peichl和Bolz(43)将视网膜暴露于gydF4y2Ba红藻氨酸gydF4y2Ba诱导结构重构(图10)，他们将其描述为成年哺乳动物(猫和兔)视网膜水平细胞的剂量依赖性形态变化。当然，他们发现高浓度的海蓝酸会杀死细胞，但当暴露在亚致死剂量下时，水平细胞收缩树突场，并向视网膜内部发送萌芽过程。他们的结论是，原话是:“海氨酸似乎可以诱导神经元生长和退化，形态可塑性的潜力仍然存在于成年哺乳动物视网膜的神经元中。”因此，在一定的实验条件下，视网膜神经元似乎可以重塑和可塑性首次提出在鱼类以外的物种。gydF4y2Ba
我们现在从对视网膜变性的研究中了解到，成年哺乳动物的视网膜在受到损伤时可以发生大量的可塑性和异常重组。本章的其余部分说明了视网膜在创伤性和退行性视网膜疾病下的可塑性。gydF4y2Ba
7.哺乳动物视网膜色素变性类疾病中发生的可塑性和重塑gydF4y2Ba
已经提到过，在1960-70年代，对患有色素性视网膜炎(RP)的人类视网膜或患有这种类型退行性变的啮齿动物模型的视网膜进行了经典组织学检查，得到的印象是除了光感受器退行性变(图6)，其余的神经视网膜是正常的。电子显微镜显示，视网膜内的神经泌除了光感受器变性外，还发生了其他变化。gydF4y2Ba
1967年和后来的1974年，RP文献中的超微结构研究记录了该疾病的常染色体显性形式(44,45)。随后，Szamier、Berson等人(46,47)发表了论文。这些论文都集中在色素上皮细胞和病变视网膜中的视杆细胞和视锥细胞的状态上，因为在当时的电子显微镜下，似乎只有这些才可以被识别为视网膜元素。在所有这些例子中，杆状光感受器都退化或完全缺失。中央凹的球果保存完好(图11a)，但中央凹外的球果减少为内节根(图11b)。高倍镜显示中心凹锥体外节盘紊乱(图11c和d)，但推测这些是功能性的，因为在EM检查中，患者的视力矫正了20/25(图11)(44)。在RP视网膜中没有检查到中心凹内视网膜，中心凹旁区域的内视网膜是一种由空泡和碎片组成的难以区分的组织(图11b)。gydF4y2Ba
Kolb和Gouras(44)也能够观察到人类RP视网膜中的骨针(图12)。这张电子显微镜图显示，组成色素团块的细胞与周围色素上皮细胞的类型相同。这一观察指出，RPE细胞已迁移到神经视网膜，从而形成晚期色素性视网膜炎的特征性骨针，可见于眼底摄影(gydF4y2Ba图4)gydF4y2Ba．这一早期发现现在可以解释为视网膜的可塑性和重塑，以应对视网膜完整性的退化。gydF4y2Ba
图13。RCS大鼠视网膜水平细胞树突的萌发。gydF4y2Ba50微米厚的RCS-截面gydF4y2BardygydF4y2Ba+ (A)和RCS (B)大鼠视网膜，神经节细胞层在上(神经节细胞层不可见)。内核层。箭头表示色素上皮。答:在RCS -gydF4y2BardygydF4y2Ba+视网膜，CaBP标记的水平细胞突局限于OPL的狭窄丛，细胞体局限于外INL。酒吧= 25µm。B.在RCS大鼠视网膜中，CaBP标记的水平细胞突贯穿外核层和碎片区，呈弯曲肿胀状。一些体细胞从INL中移出，在显微镜照片中最左边的细胞中可以明显看到。酒吧= 25µm。gydF4y2Ba选自楚，汉弗莱和康斯特布尔，1992。(48)。gydF4y2Ba
直到近20年后，另一篇论文发表，研究了视网膜组织的异常可塑性。1993年Chu、Humphrey和Constable(48)的论文显示，RCS大鼠表现出退化视网膜水平细胞过程的视网膜重构(尽管他们称之为无序)(图13)。有趣的是，他们还注意到视网膜的“紊乱”并不一致，最“紊乱”的水平细胞位于视网膜的后极，那里所有的外核层都丢失了。这些水平细胞也表现出明显的形态畸变，有“肿胀”或肥厚。gydF4y2Ba
1995年，Li、Kljavin和Milam(1)报道了在15个人类RP样本中，视紫红质阳性神经突起从光感受器层向下延伸到视网膜内部和神经节细胞层(图14)。这是第一篇表明神经突从光感受器细胞中萌发的论文，并最终证明了视紫红质在光感受器细胞的膜上离域，显然是在错误运输之后。作者在论文中提到，“人类RP视网膜中的杆状神经突类似于Müller细胞或纯化的N-CAM上培养的杆状神经突形成的长枝状突起”。事实证明，他们比想象的更正确，我们稍后会看到，Müller细胞在退化视网膜中形成了细胞迁移的导管或支架。这篇论文也是开创性的，因为作者在这篇文章中考虑了治疗的潜在影响，并提出“视网膜微环境的这些变化可能阻碍移植光感受器的功能整合”，为多年来被忽视的生物移植社区敲响了警钟。gydF4y2Ba
图15。正常(A)和分离(B, C, D)视网膜切片的抗蛋白激酶C标记。gydF4y2Ba(一)正常的视网膜。标记只发生在杆状双极细胞中，包括外丛状层(OPL)的细树突，内核层(INL)的细胞体，轴突和轴突末端。(B)视网膜脱离1天。标记存在于延伸到外核层(ONL)的两极细胞突起中。神经节细胞层(GCL)的其他细胞类型也开始出现微弱标记。(C)视网膜脱离1天。ONL中不同区域双极细胞标记的放大倍率高于c (D) 28天视网膜脱离。低倍镜显示标记双极细胞突起延伸至ONL。视网膜内较弱的信号来自其他类型的细胞，包括穆勒细胞和星形胶质细胞，并且不会延伸到内丛状膜层(IPL)。A、C和D是九幅图像的投影; B, is a projection of 13 images. Bars, 20 µm.选自Lewis, Linberg和Fisher, 1998。(26)。gydF4y2Ba
三年后的1998年，gydF4y2Ba刘易斯gydF4y2Ba、Linberg和gydF4y2Ba费雪gydF4y2Ba(26)探索了实验性视网膜脱离中的水平和杆状双极细胞(图15)。他们最终证实，在猫视网膜脱离的反应中，从杆状双极细胞投射到外核层(ONL)的细微树突状突起异常生长。他们还注意到水平细胞突起生长为ONL，并得出结论，水平细胞和杆状双极细胞的突起“在视网膜脱离后会延长，可能是对它们的突触前靶点(光感受器突触终端)的消退的反应。”关于对致盲性疾病的干预，重要的是这些作者还提出了视网膜内神经元发芽的含义，用于视网膜光感受器移植等治疗。这项工作在Webvision的另一章中有详细的记录，gydF4y2Ba视网膜脱离诱导的哺乳动物视网膜细胞重构gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图16。抗视蛋白(绿色)在正常和色素性视网膜炎视网膜中的免疫标记。gydF4y2Ba外核层(ONL)、内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)的细胞核被碘化丙啶染成红色。比例尺= 20 μm。(左图)正常视网膜(UW-0802-95)。视蛋白免疫标记(绿色)在外节段(OS)最强，在外核层的杆状体细胞的质膜和外丛状层的突触中较弱。(右图)视网膜色素性视网膜炎(ffb340)。外核层(ONL)中视蛋白(绿色)和反应性Müller细胞中胶质纤维酸蛋白(红色)的定位。杆状神经突与胶质纤维酸蛋白阳性Müller细胞表面密切相关。内核层。比例尺= 25 μm。gydF4y2Ba来自Fariss, Li和Milam, 2000(4)。gydF4y2Ba
两年后的2000年，Fariss、Li和Milam(4)检查了人RP视网膜中的杆状光受体、无分泌细胞和水平细胞，并证实了这些细胞类的异常萌发，特别是在GABA阳性无分泌细胞和calbindin阳性水平细胞中(图16)。他们还注意到投射到视网膜内部的杆状神经突，至少与GABA阳性的无分泌细胞的体细胞有联系，尽管没有提到突触连接。这项研究延续了之前的工作，将gaba能的无分泌细胞加入到视网膜中的神经元中，这些神经元促成了开始出现的重新连接现象。在这篇论文中还值得注意的是，作者注意到这些变化可能形成了患者注意到的一些心理生理异常的基础(gydF4y2Ba光幻视gydF4y2Ba以及视觉幻觉)，也是RP患者视觉功能渐进性下降的基础。Li等人在1995年的论文(1)中再次重申，这些改变可能会使视力拯救策略复杂化。gydF4y2Ba
图17。神经丝抗体全贴壁染色。gydF4y2Ba比较wt视网膜OPL中水平细胞轴突末梢形成的紧密网络(A)与rd中肥厚过程的松散排列(B)。gydF4y2Ba来自Strettoi和Pignatelli, 2000(7)。gydF4y2Ba
同样是在2000年,gydF4y2BaStrettoigydF4y2BaPignatelli(6)表现在gydF4y2Bard鼠标gydF4y2Ba，一个RP、双极性和水平细胞的动物模型，经历“伴随光感受器丢失的形态学改变”(图17)。作者的结论是，这些修饰依赖于光感受器的丧失，这再次引发了对视网膜拯救模型的潜在影响的担忧。gydF4y2Ba
图18。牛磺酸、甘氨酸和谷胱甘肽分别分布在红色、绿色和蓝色通道中，显示出不同的细胞类别。gydF4y2Ba
2000年也是我们的研究实验室带着一些沉默进入视网膜退行性疾病研究领域的一年。Robert Marc在5年前发表了第一篇使用计算分子表型(CMP)的论文(49)，我们正忙于使用这些技术来探索哺乳动物和非哺乳动物的视网膜。CMP融合了抗半抗原IgG库、组织阵列制作和计算模式识别3种技术。CMP允许同时定量探测多个免疫标签(3-20或更多)gydF4y2Ba半抗原gydF4y2Ba在所有细胞中具有亚细胞分辨率的特异性IgG探针。这项技术描绘了组织中每个细胞的代谢状态。图18是人类视网膜组织分子数据的典型三空间重构，使用红色(r)、绿色(g)和蓝色(b)颜色空间直观地呈现组织中小分子浓度的差异标记。在图18中，我们可以看到牛磺酸、甘氨酸和谷胱甘肽的表现，显示血管脉络膜在顶部为蓝色，RPE为粉色，感光细胞分类为橙色，带有低浓度甘氨酸的on -锥体双极细胞为浅绿色，这是由于与AII和其他甘氨酸能无分泌细胞耦合，其细突起向下延伸至IPL为亮绿色。gydF4y2Ba
我们对视网膜的正常回路很感兴趣，并高度关注，对病理学毫不感兴趣，但两件事把我们带进了这个领域。第一件事是Ann Milam慷慨地赠送了一些人体RP组织来进行研究。在这一点上，我们对视网膜重构的了解相对较少，基本上不知道上面提到的这些少数研究。也就是说，在处理米拉姆博士发给我们的组织后，我们首先看到的是下面这张图像。gydF4y2Ba
图19所示。RP患者视网膜晚期分子成像，牛磺酸、甘氨酸、谷胱甘肽分别映射到红色、绿色和蓝色通道。gydF4y2Ba
从最初的分析中得到的第一个图像如图19所示。我们对它所揭示的一切毫无准备。事实上，公平地说，因为我们没有上下文来理解我们所看到的，我们完全困惑了，因为拓扑看起来一点也不像视网膜。在这张小分子映射的图像中，如图18所示，你可以看到视网膜的整个拓扑结构都被改变了。上面本该是光感受器的东西现在变成了Müller细胞密封。Müller细胞显示为暗红色。亮绿色的甘氨酸能无分泌细胞在其层压和外观上混杂和改变。视网膜上可见分离的RPE细胞带有点状浅绿色标记，未知的富含谷胱甘肽的细胞呈蓝色。尽管有些好奇，我们不知道如何处理这些组织，把它们放在一边，回到我们所知道的正常脊椎动物视网膜。gydF4y2Ba
图20。牛磺酸、谷氨酰胺和谷氨酸分别映射到红色、绿色和蓝色通道的GHL小鼠视网膜图像。gydF4y2Ba
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第二个将我们带入视网膜退行性疾病研究的事件是一个同事，gydF4y2Ba珍妮弗雷德里克gydF4y2Ba她带着衰老的GHL小鼠样本(adRP模拟物)来到实验室，她和gydF4y2Ba沃尔夫冈BaehrgydF4y2Ba(28)，问我是否对“一些年老失明老鼠”的视网膜感兴趣。弗雷德里克博士提供的组织被渗透，分成块，准备切片用于透射电子显微镜(TEM)检查。CMP与TEM分析兼容，因此我们决定看看退化模型中衰老小鼠视网膜的样子，我们惊讶地发现，这些GHL小鼠视网膜与Ann Milam发送的人类RP视网膜的组织非常相似，并表现出与人类RP视网膜相同的进行性退化(图20)。gydF4y2Ba
问题是，有很多论文明确地指出，神经视网膜对光感受器的丧失是不敏感的。为了探索这种冲突，我们在接下来的几年里开始追踪我们所能找到的尽可能多的视网膜退化例子，使用自然模型和工程模型，包括S334ter大鼠，P23H大鼠，RCS大鼠，rd1小鼠，GHL小鼠，TG9N小鼠，nr，或，chx10, pcd, rd2, rho-/-，， rdcl, hrhoG, GC1&2 DKO, rhoDCTA小鼠模型，以及P347L兔和P23H猪。我们还研究了诱导模型，如光损伤模型和氧化应激模型。来自世界各地的同事非常慷慨地帮助我们gydF4y2Ba马特LaVailgydF4y2Ba不仅如此，他还贡献了过去30年里收集的几十个样本。从这项工作中得出的基本事实是，无论我们在哪里观察视网膜变性，尽管有很多视网膜移植和视力拯救的文献，我们都看到了视网膜从分子到组织尺度的重塑。gydF4y2Ba
真正令人震惊的是，当时的文献工作是如此之少。例如，当我们在2003年回顾文献时，只有不到30篇关于视网膜退化的论文提到视网膜内部神经元。gydF4y2Ba
值得注意的是，这个群体被错误地告知视网膜的状态是，在这种疾病的晚期形式的组织学，与视网膜的正常外观有很大的不同。其中一个解释可能是啮齿类动物的模型很少能超过一岁，对许多研究人员来说，一旦光感受器退化，他们就不会再等待更剧烈的变化发生。也就是说，虽然视网膜疾病的老年啮齿类动物模型并不常见，但研究晚期人类疾病有很多机会。我们对高级人类RP的研究揭示了胶质基质的显著变化，并显示了由视网膜中所有神经元细胞类别的神经元芽产生的称为微神经元瘤的新结构(图21)。gydF4y2Ba
值得注意的是，视网膜的重塑和可塑性并不专属于RP和RP样疾病。除了人类RP和RP模型，我们还检查了人类AMD组织，发现了涉及双极细胞和Müller神经胶质应激反应的重塑和视网膜可塑性的大量证据(23)。图22是一位早期诊断为地理萎缩的患者。值得注意的是，文献中有一些其他的论文记录了AMD的重塑(8,50)。gydF4y2Ba
在白化病小鼠/大鼠中，光诱导视网膜变性(LIRD)是一种诱导模型，它代表了光感受器的相干应激损伤，导致光感受器大量丢失，随后视网膜重构和重编程(31)。再次，神经视网膜的整体解剖结构，特别是内核层、内丛状层和神经节细胞层似乎正常或接近正常。然而，在LIRD早期，视网膜内的关键突触标记物表现出对光感受器应激的快速内视网膜反应，导致神经元反应的功能重编程。这种重编程是AMPA GluR2亚基的结果，主要与视网膜内部处理相关，显示出蛋白质水平的快速变化。光损伤后60天内，LIRD中GluR的表达发生变化，低导AMPA受体GluR2亚基增加65%，高导KA受体GluR5亚基减少50%。AMPA受体GluR1亚基表达无明显变化(51)。在随后的LIRD中，有大量的变化和神经元从神经视网膜“逃逸”，双极和无分泌细胞通过Bruch膜的断裂进入脉络膜间隙(图23)。gydF4y2Ba
图24。视网膜来自23月龄雄性DBA/2J小鼠GABA标记。gydF4y2Ba标记显示异常的GABAergic无分泌细胞重构，新的神经突向上突出到外丛状层。比例尺= 30μm。gydF4y2Ba
我们已经探索的视网膜可塑性的另一个非RP模型是gydF4y2BaDBA / 2 j鼠标gydF4y2Ba青光眼的典范。gydF4y2Ba昆卡gydF4y2Ba(52)在成年白化瑞士小鼠眼压升高的眼内模型中显示了on -棒双极细胞和水平细胞的重塑事件(52)。在我们的实验室与gydF4y2Ba莫妮卡检查者gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAlejandra黄宗泽gydF4y2Ba显示了gaba能无分泌细胞过程的重塑事件(图24)，这表明视网膜的负可塑性不仅限于光感受器失传入。gydF4y2Ba
8.TgP347L兔和P23H猪视网膜色素变性模型gydF4y2Ba
除了小鼠模型，目前还有两个可行的大眼睛RP模型。其一，图25所示的P23H猪(53)含有Pro23His (P23H)视紫红质(RHO)突变，这是在人类中观察到的最常见的常染色体显性RP (adRP)形式。RP的猪P23H模型显示光感受器的渐进性丧失和视觉感知的丧失(ERG测量)(53)。此外，这些猪模型显示了在人类(图22)和其他视网膜变性模型(图30)中所见的异常Müller细胞特征，通过ERG(53)测量，光感受器逐渐丧失，随后视觉感知丧失，就像人类啮齿动物和兔子(22,23)一样。在视网膜光感受器变性之前，猪组织中gaba能和甘氨酸能无分泌细胞群也表现出神经芽生，这表明系统中存在应激源，可诱导内神经视网膜的下游反应。gydF4y2Ba
P347L TG兔由近藤美雄(Mineo Kondo)和寺崎弘子(Hiroko Terasaki)制备为常染色体显性RP大眼模型(54)。兔表达了一个视紫红质脯氨酸347到亮氨酸的转基因基因(图26)。Drs。同年，近藤和Terasaki找到我们，对这个模型进行评估，并将其与RP模型以及人类RP模型进行比较。这项研究发表于2011年，记录了视网膜变性的进展以及随后的感觉和神经视网膜重构(22)。我们在分子水平、生理水平和组织学水平上分析了变性、重构和重编程，并表明TgP347L兔的疾病进展密切跟踪人类锥体保留RP，包括锥体相关的双极细胞信号的保存和谷氨酸通道重编程的触发。gydF4y2Ba
TgP347L兔和P23H猪模型作为视网膜疾病的模型具有吸引力，原因有很多。该模型是一个大的眼睛模型，在眼科已有大量的知识基础，包括视网膜解剖和回路。TgP347L兔的一些优点是疾病进展相对较快，加上易于管理和负担得起的方法，使TgP347L兔成为基因治疗、细胞生物学干预、祖细胞移植、外科干预和仿生假体研究的优秀模型。gydF4y2Ba
由于TgP347L兔与人类adRP的相似性，下面的大部分重构具体讨论将来自该模型系统的数据。gydF4y2Ba
哺乳动物视网膜的视网膜退化是阶段性的。第一阶段以光感受器应激为典型，这是细胞和分子水平上早期重塑和临床隐性重编程事件的开始。视网膜重塑的第二阶段包括小胶质细胞、Müller胶质细胞和RPE细胞，因为Müller胶质细胞开始表现出细胞应激的迹象，并对退化的视网膜产生反应。Müller细胞也开始肥大，并在感光细胞之间生长，启动Müller细胞密封。ONL中的细胞死亡也在第2阶段开始发生。第三阶段是我们开始看到神经细胞从所有的神经细胞类别中发芽产生新的神经回路。神经元细胞死亡也开始发生在双极、水平和无分泌细胞群中。视网膜重构的最后阶段是神经视网膜失去细胞，无法将连贯的视觉通路信号传递到更高的中枢进行处理。gydF4y2Ba
Tg P347L兔视网膜变性和重构的进展与人类RP中所见事件的后遗症密切相关，尽管它似乎以加速的速度发展到1岁时光感受器完全丧失。TgP347L兔在12-16周时，视网膜重塑的第一阶段在视网膜退行过程的早期就已经开始了，而光感受器还没有退行。除了光感受器的外部部分有一些紊乱外，光感受器的结构看起来基本完好。外节段的一些部分脱落，似乎停留在视网膜下间隙，而不是被RPE吞噬(图27)。该区域最引人注目的特征是在视网膜下RPE/光感受器界面空间中，有大量的小泡状棒光感受器外节段断裂并出现视紫红质“泡沫”。我们推测这种“泡沫”增加了RPE和光感受器细胞中的氧化细胞应激。gydF4y2Ba
在Tg P347L家兔中，40周后仍然可以在视蛋白的视锥细胞中发现表达，然而，这种视蛋白的离域与Li等人在1995年所描述的非常相似(1)。虽然仍然可以发现大量的光感受器，但视紫红质离域进入细胞体周围的膜表明存在大量的光感受器细胞应激(23)。gydF4y2Ba
图28。4月龄Tg P347L兔视网膜Müller细胞显示不同谷氨酰胺信号。gydF4y2Ba
图28显示了4个月时Tg P347L兔视网膜1-2期谷氨酰胺免疫反应性，此时Müller细胞间谷氨酰胺信号开始发生变化。谷氨酰胺存在于大多数视网膜神经元中，但最显著的是Müller细胞。在RPE细胞中也发现了高浓度谷氨酰胺，但在4个月时，分离的Müller细胞中的谷氨酰胺水平显示出多种代谢状态，这是在正常视网膜中从未观察到的结果(22)。gydF4y2Ba
图29。10个月大的Tg P347L兔视网膜的6个面板组成的全景图像，显示镶嵌的谷氨酰胺合成酶(GS)表达。gydF4y2Ba
在Tg P347L兔视网膜10个月后进入第二阶段，谷氨酰胺合成酶(GS)水平也显示出定量不同的表达水平(图29)。GS介导谷氨酸、GABA和氨的循环，形成谷氨酰胺，并在一些Müller胶质细胞中显著不受控制，这解释了图28中观察到的谷氨酰胺镶嵌水平，但也特别揭示了硝酸盐还原和氨基酸降解途径在退化视网膜中发生了改变(22)。gydF4y2Ba
tQE:: rgb (t-牛磺酸，红色;Q-glutamine,绿色;e -谷氨酸，蓝色)可视化(图30)允许视网膜色素上皮和Müller细胞被观察到独立于所有其他细胞类别。在这个可视化图中，l -谷氨酸和牛磺酸的联合标记显示了3个存活的锥体突出在Müller细胞密封(粉红色细胞)之上。此外，Müller细胞信号的嵌合性很明显，显示了小分子信号的病理异质性。在视网膜的这个区域，Müller细胞密封基本上是完整的，将神经视网膜与RPE和脉络膜隔离开来，视网膜除了该区域的3个孤立的锥状光感受器外，没有任何光感受器(22)。gydF4y2Ba
FigydF4y2BaggydF4y2Ba保证31。最大的职业gydF4y2BajgydF4y2Ba检验imagydF4y2BaggydF4y2Bae的PKC(红色)，Rho 1D4gydF4y2Ba(ggydF4y2Ba的DAPI(蓝色)gydF4y2BaTg P347L兔视网膜gydF4y2Ba．gydF4y2Ba图展示了rgydF4y2Ba低视紫红质免疫反应性(ONL中的绿色斑点)和一些杆状双极细胞(红色)具有异常树突和轴突(小箭头)，与IPL下部的正常杆状双极轴突终端(白色括号，在)相比。gydF4y2Ba
第三期为广泛的新生神经突形成、新突触形成和神经元死亡。Tg P347L兔的视网膜在10个月后完全参与了第三期重塑。蛋白激酶C免疫反应性(PKC)、视紫红质1D4免疫反应性(Rho 1D4)和核染色(DAPI):: rgb的最大共聚焦投影图像显示，不仅与退化的杆状光感受器相关的视紫红质免疫反应性降低，而且双极细胞轴突已成为多极细胞，沿IPL顶部边缘突出(图31)。这些过程延伸到双极细胞群的正常层压外，穿过IPL，形成肿胀，也提示突触连接，提示新的视网膜连接(22)。这些双极细胞也会下调iGluR和mGluR6的表达，这是之前在啮齿动物和人类视网膜退行性疾病中观察到的结果(31)。gydF4y2Ba
Tg P347L兔视网膜的另一个区域在10个月时，也可以通过水平细胞持续形成的神经突记录第三期重塑。在图32中，最大投影共聚焦图像显示PKC、calbindin(一种钙结合蛋白)和DAPI:: rgb的免疫组化，显示水平细胞中calbindin的标记。水平细胞突起以异常的方式投射到IPL中(22)。Calbindin曾被广泛用于检测水平细胞群的变化(4)，这些结果与在人类视网膜中观察到的结果很吻合。gydF4y2Ba
在Tg P347L兔10月龄第3期，观察无分泌细胞的神经突发芽，发现新的gaba能和甘氨酸能神经突形成。图33为yGE:: rgb可视化光感受器、双极细胞、GABA+(g)和甘氨酸+(g)无分泌细胞和谷氨酸+(E)神经节细胞超类。总的来说，IPL的层压似乎正常，但这掩盖了视网膜中正在产生新的神经突的兴奋性和抑制性细胞群，如图30所示，细丝状品红色信号运行在Müller细胞封层之下，在大多数剩余的双极细胞群之上(22)。gydF4y2Ba
图34。gydF4y2Ba图中的GABA通道gydF4y2Ba33显示在Müller细胞和位于Müller细胞密封下方的GABA能无分泌细胞的异常神经突中GABA表达增加。gydF4y2Ba
图34显示了10个月时Tg P347L兔视网膜重塑3期GABA的标记，显示GABA能无分泌细胞的萌发。同样，GABA免疫反应显示IPL的整体分层显示正常。虽然早期GABAergic发芽事件。持续的神经突形成，新的突触形成和神经元死亡(22)。这仍然是第三阶段的早期阶段，在Müller细胞继续肥大反应和每个细胞类别中额外数量的细胞死亡发生大规模的地形重组之前。gydF4y2Ba
图35。gydF4y2Ba在10.5月龄hrhoG小鼠中，GABA通道显示微纤维瘤的形成。gydF4y2Ba
从无分泌、双极、水平和神经节细胞群中萌发的细胞可以继续细化其结构，形成大量的gaba能、甘氨酸能和谷氨酸能过程的缠结，形成微神经元瘤或视网膜成熟和发育后重新形成的神经泌簇。这些微纤维瘤打破了传统的网状层压规则，在图35中可以看到hrhoG小鼠的IPL中爆发，并上升到RPE下的视网膜顶部。gydF4y2Ba
在第三阶段的后期，持续的神经突形成，新的突触形成和神经元死亡，所有类型的细胞都参与其中。随着细胞类别不断从双极细胞、无分泌细胞、水平细胞和神经节细胞中萌发出突起，许多突起开始在具有突触连通性的微神经元结构中共束并一起运行。图36是Müller细胞密封区域内从一个位置移动到另一个位置的神经突起的集合。微神经元不是沉默的结构，因为它们既包含带状突触，也包含常规突触，有许多突触排列，包括但不限于无侧突触>无侧突触、双相>无侧突触、无侧突触>双相和双相>双相双相(9)。gydF4y2Ba
9.视网膜中最早的变化发生在明显的组织学变化发生之前。gydF4y2Ba
图37。gydF4y2Ba双极细胞重构的动画，其中杆状光感受器死亡，随后锥状光感受器在稍后的时间点死亡。gydF4y2Ba
在RP模型中，杆状细胞和锥状细胞同时死亡，双极细胞失去树突和所有iGluR/mGluR反应性。从0-1期开始，杆状双极细胞下调树突中GluR的表达。在1-2阶段，杆状和锥状光感受器应激和随后的细胞死亡发生，而树突状模块丢失。在第三阶段，视网膜重构范围扩大，导致新的轴突模块的萌发和形成。在视锥细胞比视杆细胞寿命长的RP模型中，一些双极细胞树突会切换靶点。在正常的棒状双极细胞结构中，棒状双极细胞的树突绕过锥蒂。在0-1期，与杆状/锥体营养不良一样，杆状双极细胞下调树突中GluR的表达。在第1-2阶段，随着杆的应力和死亡，树突模块丢失。在第二阶段/第三阶段后期，部分杆状双极细胞形成芽，与锥体蒂接触，在锥体蒂上形成外周接触。图37和38总结了视网膜RP型变性所经历的退化阶段，如上所述。 In human RP it is clear that the peripheral retina goes into phases 1-3 long before the central retina and fovea does. The RP patient eyes that have been looked at with good anatomical techniques have phase 3 retina in the periphery and phase 1 in the fovea (4, 44, 46, 47, 55).
10.结论gydF4y2Ba
从根本上说，在迄今为止检查的每一个视网膜疾病和视网膜退化模型的实例中，视锥细胞的存活似乎至少推迟了第3期重构的大体开始。这可以在视网膜局部斑块中看到，那里的视锥细胞和保存下来的双极细胞树突状结构持续存在。即使视锥细胞严重受损，缺乏外部节段、视觉色素表达和形态改变，只要视锥细胞存在，视网膜似乎就能保持第二阶段的状态。这可能表明整合素的参与或证明仅通过已建立的电路连接就足以维持ca2 ++信号和基因表达谱。至少，它提供了证据，证明延长视锥细胞存活对于维持视力或使后续的视力拯救(如生存因子、干细胞或祖细胞移植、胎儿视网膜片移植和基因治疗)更成功是一个实质性的优势。gydF4y2Ba
当我们在遗传模型中使用各种旨在延迟或恢复视力的治疗方法时，我们需要考虑视网膜可塑性所显示的潜力。例如，第一和第二阶段的视网膜重构可能是可逆的，实际上可能对正确的治疗干预有反应。然而，当视网膜进入第三阶段时，随着其线路和神经细胞生成、细胞迁移和细胞死亡的改变，可能已经太晚了。视杆细胞和视锥细胞的基因疗法的问题在于，它们依赖于光感受器的存活。如果我们能延长锥体的存活时间，这可能为“治愈”指明了道路。然而，正如我们上面提到的，光感受器参与视网膜退行性疾病早在光感受器死亡之前就开始了。这开始定义基因治疗可能成功的“机会之窗”，同时也表明基因治疗与生存因子的联合使用可能是通过神经营养因子的传递来延长光感受器存活的合理方法。gydF4y2Ba
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作者:gydF4y2Ba
布莱恩·威廉·琼斯博士gydF4y2Ba他是犹他大学约翰·莫兰眼科中心的副研究教授。他的工作涉及视网膜变性疾病以及这些疾病如何影响固有的视网膜回路，包括通过基因治疗和视网膜仿生或生物植入修复视力的意义。其他研究工作包括探索代谢组学在理解生理学和医学以及药物开发方面的应用。gydF4y2Ba
罗伯特·e·马克博士gydF4y2Ba他是犹他大学约翰·a·莫兰眼科中心的眼科名誉教授。罗伯特目前是gydF4y2Ba流浪箭头牧场gydF4y2Ba的首席执行官。gydF4y2Ba签名免疫gydF4y2Ba他被认为创造了计算分子显型，发展了通道映射和可视化技术，并建立了第一个具有识别神经元和映射连通性所需分辨率和特征的综合连接组。gydF4y2Ba
Rebecca L. Pfeiffer博士，目前是犹他大学约翰a .莫兰眼科中心琼斯实验室的博士后。她的研究重点是了解视网膜疾病的进展以及神经元和神经胶质的参与。目前正在使用代谢组学和连接组学相结合的方法来评估视网膜重构和神经退行性变的进展。gydF4y2Ba
我们感谢近藤美雄和寺崎博子，是他们让这项工作成为可能:gydF4y2Ba
近藤美雄，医学博士，博士，日本苏美大学医学院眼科教授，与Terasaki弘子一起负责P347L兔的生成。Mineo的工作重点是使用视网膜电图诊断各种视网膜疾病，并探索人类视网膜和视神经疾病的动物模型。gydF4y2Ba
Hiroko Terasaki，医学博士，博士，名古屋大学医院眼科教授和主席。弘子和近藤美雄负责制作视网膜退行性疾病的P347L兔模型。寺崎教授在名古屋大学医学院接受了医学和眼科培训，导师是名誉教授Hiroshi Ichikawa、Shinobu Awaya和Yozo Miyake。她还在波士顿的Schepens眼科研究所接受过广濑Tatsuo教授的指导。gydF4y2Ba