伊森·d·科恩博士
摘要
视网膜假体试图重新激活盲人视网膜上的残余电路，以合成可用的视觉。使用一系列刺激电极或光敏蛋白，退化视网膜网络中的神经元被激活，引发一系列被称为“磷光烯”的光感知。如果患者的磷烯在他们的视野中作为独立的空间感知，就可以实现一种粗略的形式视觉。这种形式的视觉可以提高视障患者在外国视觉环境中定位地标、避开障碍和改善社会互动的能力。虽然目前临床试验中的大多数视网膜假体依赖于电极阵列的电脉冲刺激来局部刺激患者的视网膜神经元，但几个研究小组也在尝试更具有生物相容性的刺激方法，称为“光遗传学”，即部署病毒将光激活的刺激蛋白基因转导到选定的视网膜神经元组，当表达时调节它们的神经活动。在将生物技术整合到失明患者退化的视网膜上，每种技术都带来了不同的挑战和好处。耦合和替换中央凹丢失的视网膜神经元仍然是电子和光基因联合治疗的挑战。在现实世界评估这些新医疗技术对患者视力的影响时，有许多共同的问题。鉴于RP作为一种疾病的异质性，多种疗法的可用性可能对患者有用，每种疗法对其视网膜变性类型及其进展程度都有不同的优势。
简介
图1患者在人体临床试验中测试视网膜假体植入物。a .在普通物体识别任务中使用Alpha IMS的视网膜下植入患者。视网膜植入AG，检索自https://www.youtube.com/watch?v=WSdmWbItsvU)．B.脉络膜上澳大利亚视网膜植入患者通过避障过程(澳大利亚仿生视觉，检索自https://www.youtube.com/watch?v=6EmleCs0KGY)．
视网膜假体试图重新激活盲人患者视网膜中的残余电路，以产生合成的可用视觉(图1)。使用一组刺激电极或光敏蛋白，退化视网膜网络中的神经元被激活，从而诱发一系列被称为“磷光烯”的光感知(图2)。如果患者的磷光烯在患者的视野中作为独立的空间感知，则可能实现一种原始形式的视觉。
图2所示。早期的例子电膦像产生的肉眼刺激的眼睛。浦肯野(Purkinje)报道的自诱导膦烯图，[1]是由其口腔和前额导体之间的直流电刺激产生的(图3.2中的分图15、16)。通过瞬态电流刺激结膜也能产生类似的电磷。
这种形式的视觉可以提高视障患者在外国视觉环境中定位地标、避开障碍和改善社会互动的能力。迄今为止，所有的假肢设计都依赖于相同的通用图像编码策略来产生视觉。丢失的光感受器镶嵌被替换为位于一副眼镜或光电二极管芯片中的人工硅光感受器阵列(图3)。光感受器适应被电子自动增益控制取代。为了模拟水平细胞和无分泌细胞对神经节细胞感受野的对抗性中心环绕对比度增强，视频处理器芯片对观察图像进行缩放和边缘增强。然后，神经编码器电路将下采样图像转换为一组有限的离散刺激水平，适合在可用的动态响应范围内激活视网膜网络(例如，调节神经节细胞的峰值频率或视网膜内部神经元的梯度电位)。最后，刺激器利用这一水平信息改变视网膜神经节细胞的放电模式，这些细胞的动作电位向上传播到视神经，在大脑视觉区域产生磷烯模式。虽然目前临床试验中的大多数视网膜假体依赖于电极阵列产生电脉冲的刺激物来局部刺激患者的视网膜神经元，但一些研究小组也在尝试被称为“光遗传学”的更生物兼容的刺激方法，这种方法部署光激活的刺激蛋白斑块，在视网膜神经元组中表达，以选择性地调节它们的神经活动。为了达到有效的效果，视网膜假体不仅要提高视力表上的视力，还要提高在现实世界中不受控制的照明环境任务中的视觉表现，如找门、在街道上导航、社交和其他日常生活活动。HOVER联盟目前正在制定这些假体设备的患者性能测试指南，以便更好地比较设备结果[3]。有关早期视网膜假体的描述，请参阅评论[4]，[5]，[6]和[7]。
图3视网膜假体图像编码和刺激方案。图像框显示天然视网膜的机制和它的假体替换。一个例子是使用对比度增强方法转换250×250像素的人脸彩色图像进行视网膜刺激。摄像机采样的彩色图像被转换为256灰度b/w图像，用Sobel算法[8]进行边缘检测，去鳞到125×125像素图像，减少到25×25像素的刺激模式，具有10个亮度级别，与Argus II患者的能力类似，~6-10级[9]，并使用外部电流脉冲(通过光电二极管或电磁耦合)来刺激视网膜神经元，或者在显示器上的光脉冲激活外源表达的转导神经元的光敏离子通道(光遗传学)。乔治沃尔德的形象好心提供的伊利亚沃尔德。
视网膜假体患者:
在视觉假体临床试验中，有一组患者患有一种被称为“色素性视网膜炎”(RP)的严重视网膜变性。随着时间的推移，患者的外周视杆和视锥逐渐丧失，导致中心视野狭窄，直径约3 - 10◦。在眼底检查中，由于RPE细胞迁移到视网膜，视网膜周围开始出现带有“针状”外观的色素病变。RP的疾病进展是高度可变的，然而，一个较小队列的患者进展到所谓的“晚期RP”，其特征是杆状和锥状光感受器几乎完全退化，导致光感赤裸或无光感(见[10]，[11]，[12])。目前，这一晚期RP组的患者是视网膜假体的主要使用者。
RP是一种遗传异质性疾病，包括杆锥营养不良症、Usher综合征和Leber先天性黑蒙。RP涉及的突变数量非常大，有相当数量的患者临床上可能存在未知的遗传变异[13]。RP遗传类型可以是常染色体显性、x连锁、隐性和单纯型，来自大约100个不同的基因家族(RetNet, 2017年3月)。这种异质性对个性化基因治疗提出了严峻的挑战，如自体干细胞移植，CRISPR-Cas9基因切除技术，或最近批准的双等位基因RPE65视网膜营养不良基因治疗，这可能需要及时识别缺陷和选择性治疗每个受影响的个体。对一些RP亚型狗模型的基因治疗研究表明，早期的基因干预是必要的，因为视网膜退化可能会在基因治疗后继续，[14]。相比之下，视网膜假体(电子和光遗传学)治疗不依赖于疾病基因突变，这可能使更大的假体患者队列受益。
RP患者的末期视网膜也显示出视网膜网络中解剖组织、受体和功能的显著重塑和重组(详情见Marc等人的Webvision entry)[15]、[16]，这对替换失去的光受体和中心凹锥的假体疗法(例如[17]，[18,19])提出了挑战。双极细胞树突从死亡的中央光感受器末端收回其突起(见[5]，[16,19 -22])。内核层的双极细胞和无分泌细胞通常通过异常的突触接触而存活。RP患者的视网膜神经节细胞数量平均下降30%，这些神经节细胞的轴突对通过视神经[23]将磷光诱发的峰值发送到大脑至关重要。由于所有的视网膜假体都依赖于功能正常的视网膜神经节细胞的存在，因此候选假体通常使用角膜刺激电极来诱导被称为“电诱发反应”(EER)的电诱发磷光烯([24]，[25]，[26])来评估神经节细胞功能。目前，视网膜假体主要有两类:电视网膜假体和光视网膜假体。
电刺激视网膜假体:
大量的视网膜假体通过使用电流脉冲去极化和激活视网膜网络中的神经元来诱导盲人患者恢复视力。使用电刺激的视网膜植入物根据其刺激电极在眼睛中的位置进行分类。假体电极可以放置在视网膜内表面或内限制膜(ILM)(视网膜前)，或放置在视网膜下间隙(视网膜下)，或放置在脉络膜血管后面的巩膜(称为“脉络膜上或巩膜上”)，或放置在视神经(视神经)上(图3)。每个植入电极位置在刺激视网膜回路方面都有不同的优缺点。无花果。4、5。
图4。电刺激假体刺激电极阵列电极的位置和视网膜前假体示例。A:人类中央凹旁视网膜切片，显示主要刺激电极位置和视网膜层:(来自[5]，并获得IOP Publishing的许可)。神经纤维层轴突(NFL)，神经节细胞层(GCL)，内丛状层(IPL)，内核层(INL)，中心凹锥体突触延伸的Henle纤维层，外丛状层(HFL)，外核层(ONL)和色素上皮(PE)。B,C:视网膜前类型的视网膜假体的例子。B: Argus II视网膜假体(美国FDA 2013年)。C: IRIS 2视网膜假体。图片由第二视觉医疗产品，pixxium Vision提供，并获得许可。
外层电极接口
视网膜前假体电极放置在视网膜的内限界膜上，以便局部刺激下的视网膜神经节细胞和视网膜内神经元。通过ora serrata的切口，外科医生通过外科手术植入靠近ILM表面的柔性刺激电极阵列;用一个或多个视网膜钉固定。该阵列通过电缆连接到刺激盒和线圈，线圈缝合在地球仪的外面，并由巩膜带固定。安装在患者相机眼镜臂上的遥测线圈向植入线圈提供无线电源和数据信号。袖珍可视处理器/电池单元允许用户选择观看模式。Argus I是临床试验中的第一个视网膜前假体，它使用了改良的耳蜗植入刺激器，并有一个直径250-500米的4 × 4铂(Pt)视网膜前电极阵列[27]。视网膜上电极大小的视觉尺度，1度视角在视网膜上约为280µm。这是食指指甲在一臂长度[28]处的视野大小。其他临床测试的早期视网膜前假体设计包括Epi-Ret[29]和IMI视网膜植入[30]。 The “Argus II Retinal Prosthesis System” is currently the only retinal prosthesis legally marketed in the U.S. It was approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) in 2013 as a humanitarian use device, and was CE marked (EU) in 2011.
Argus II使用6×10阵列的200 μ m直径的铂盘电极放置在视网膜内表面(对角线视野~20°)(图2B)[31]，[32]。大多数Argus II受试者(约70%)能够在黑色地板上跟随一条白线，约55%能够在白色墙壁上找到一扇黑门(HDE FDA报告，2013年)，而少数(10%)能够缓慢地阅读黑色背景上的大白字[33]。
IRIS II是一种更新的视网膜前假体，它将基于事件的摄像机编码的视觉场景图像发送到一个由150个刺激电极组成的六边形阵列，目前在欧盟临床试验(2017)中植入了10名患者(图3C)。为了避免通过磁线圈将每个电极刺激水平作为射频(RF)信号发送的数据瓶颈，IRIS II使用安装在患者眼镜上的红外LED将刺激信号直接通过患者的晶状体传输到安装在植入物刺激电极阵列的眼内电缆上的光电二极管传感器解码器。
视网膜前电极假体的性能
视网膜前假体的优点是对视网膜的微创性，不堵塞视网膜血管，并易于通过患者的晶状体使用眼底镜或光学相干断层扫描(OCT)进行监测。在动物模型中，短电流脉冲(0.1-0.5msec)倾向于直接激活神经节细胞的动作电位。由于激活的双极或无分泌细胞的突触传递，较长时间的脉冲可能产生延迟的峰值。([34、35],[36],[37])。视网膜上电极刺激非选择性地刺激ON和off中心神经节细胞。对于Argus II用户，双相0.45msec脉冲的磷烯阈值平均为206.5µA (93nC)[32]。Argus I型受试者报告称，从单个受刺激电极上可以感知到椭圆形斑点(约4 x 10度)，或长约7-15度的细弧(1度宽)[38,39]，Argus II型受试者报告了类似的形状感知[40]。Argus II被试的荧光亮度感知仅限于6-10个刺激电流步[9]。Argus II的相机眼镜固定在患者的头部，而电极阵列则固定在眼睛的视网膜上。然而，大脑会根据患者眼睛注视的位置绘制视网膜前刺激电极诱导的磷光烯，所以如果眼睛移动，磷光烯也会移动。 Argus II subjects also report a perceptual fading of stimulated phosphenes due to a Troxler-like effect- in some cases in under 0.5 sec, so they often use head scans to study an object of interest [41].
对于视网膜前假体，刺激电极阵列与视网膜内表面的紧密构象是必要的，以便在电极阵列上提供均匀聚焦的刺激。当刺激阵列电极靠近视网膜附着区时，Argus II患者的刺激电极阵列距离视网膜表面[32]平均为179.6µm。不完全接触可能是由残留的玻璃体皮质纤维、后透明体/视网膜前膜、患者/性别在视网膜曲率上的差异以及弯曲的中央凹缺乏构象引起的。离视网膜前刺激电极最近的结构通常是来自视网膜末梢神经节细胞轴突的内限制膜下的弓形神经纤维束，这些纤维束环绕着视网膜中央凹，并汇聚于视神经头[42]，[43]，[20]。黄斑周围神经纤维层束厚度平均为80 -120um[44]，黄斑附近神经纤维层平均为33.9um[45]。使用亚毫秒刺激脉冲，受试者经常报告在电极刺激下看到弧状磷光烯(见[39]，[40,46]和[47])。最近使用10-20msec的长正弦电流脉冲的刺激策略可能会减少神经纤维的激活，从而通过单个电极改善空间感知[47]，[48]。
图5所示。电刺激脉络膜上和视网膜下假体刺激电极阵列的例子。(A,B):视网膜下，(C)脉络膜上类型的阵列。A: Alpha AMS光电二极管/刺激电极芯片阵列和电源线;B: Prima多光电二极管/刺激阵列芯片植入样机。C.脉络膜上刺激电极阵列[49]。IOVS(许可)。规模500µm。A, C:植入体外壳/线圈未显示。图片由A: Retinal Implant AG提供，B: ref [50] Nature Pub。C: ref[49]投资。 Opthalm. & Vis. Sci. (with permission).
视网膜下电极接口
视网膜下假体将电极阵列放置在色素上皮和退化光感受器层之间的视网膜下间隙(图5)。这将刺激电极放置在离盲人患者很近的地方，以激活剩余的双极细胞和无分泌细胞，理论上可以以更自然的方式激活剩余的视网膜回路。早期的视网膜下设备测试包括一个环境光驱动的5000微光电二极管刺激芯片，在美国临床试验中表现不佳[51]。然而，基于主动供电光电二极管的视网膜下刺激芯片在患者试验中更为成功，一些芯片能够阅读大字母(5-10°)([52]，[53])。第二代40 × 40刺激电极/光电二极管阵列(1600电极)芯片Alpha AMS于2016年在欧盟获得CE认证，提高了耐用性([53,54]，[55])。这种聚酰亚胺封装的组合光电二极管和基于刺激电极的芯片(3.2x4mm, 70 ?m厚)允许受试者使用合成视野~13o的自然眼睛扫描来分析物体。AMS芯片的有源电源由一根电缆提供，电缆来自于缝合在颅骨上的线圈供电盒，类似于人工耳蜗植入物。功能性植入体患者的光栅灵敏度为0.1 - 3.33 cycles/degree[55]。美国/欧盟集团正在积极开发其他几种视网膜下刺激植入物。最近，光动力光电二极管刺激电极芯片的概念被Palanker团队重新发扬光大，该芯片的像素包含多个光电二极管与一个中央刺激电极串联。当被积极照射时，每个像素产生足够的电压来刺激视网膜网络，从而改变动物模型[50]的神经节细胞放电。 Termed the “PRIMA” implant, a camera/viewscreen stimulator goggle generates IR light pulse “images” to power the implant chip array in the blind retina. A clinical trial for the PRIMA is currently started in the EU (11/2017). Other subretinal implant designs include a 256 electrode array by the Rizzo group with a more conventional globe-mounted titanium case/coil and camera glasses [56].
视网膜下电极假体的性能
视网膜下假体的优点是，其电极可以刺激外部视网膜的其余神经元，如双极细胞。这可以为盲人提供一个更协调的视觉电路激活，它将通过视网膜网络传播。在许多视网膜下设计中，光传感器也直接位于刺激电极上。视网膜内安装允许盲人受试者使用自然的眼球运动来扫描感兴趣的物体，也有助于防止静态视网膜刺激报告的感知衰退[57]。然而，视网膜下芯片也可能部分阻止来自脉络膜毛细血管床的氧气扩散，一些Alpha IMS植入患者在荧光素血管造影下显示轻度视网膜血管渗漏，[58]，见[59]。视网膜下植入设备需要一个薄的包装来适应视网膜下空间，以及一个持久的近乎密封的植入电子封装。
Suprachoroidal电极:
脉络膜上(或巩膜上)假体将刺激电极放置在脉络膜血管正后方的巩膜袋中(图5C)。一个由49个子弹状刺激电极(0.5 mm直径)组成的脉络膜上电极阵列被植入日本三名受试者的颞视网膜后面(Fujikado[49])。该阵列连接到一个多路复用刺激箱(形状类似于人工耳蜗植入物)，通过手术连接到患者的颞骨上，并由摄像头/处理器控制。使用双相脉冲(0.5msec持续时间)，大的磷光烯延伸≥10度视角被报道([60])。第二种由澳大利亚仿生视觉协会开发的脉络膜上设计使用了一个较小的20个Pt电极阵列(直径400-600um)，植入3名RP受试者靠近中央凹的颞部脉络膜上空间。电缆末端为经皮连接器，用于连接外部摄像机和刺激器[61]。使用阳极或阴极第一双相脉冲，2名受试者报告了平均直径分别为8.4和9.0度视角的磷光烯形状[62]。
脉络膜上假体的优点是电极阵列植入只需进行最小的手术，从而降低视网膜脱离的风险，而且由于从未进入眼的玻璃体腔，感染的风险也降低了。虽然脉络膜上电极位于视网膜色素上皮/脉络膜血管的后面，可以在视网膜上传播刺激脉冲电流，受试者可以感知简单的磷苯形状，这表明这些设备可能具有恢复大多数RP患者通常失去的周围视力的临床用途。然而，强烈的电膦刺激有时会在三叉脉络膜神经[60]处引起刺痛感。
视神经假体
历史上，有几个小组研究了刺激视神经，主要是使用表面电极[63]，然而每个电极似乎激活了大量的轴突，导致患者视野中出现多个磷烯感知。
表一:电刺激视网膜植入物。在人体临床试验中测试的设备以粗体显示。另请参阅http://www.eye-tuebingen.de/zrenner/retimplantlist/,http://www.io.mei.titech.ac.jp/research/retina/index.html
Neurotransmitter-releasing视网膜假体:
谷氨酸氨基酸是主要的兴奋性神经递质，用于从光感受器到双极，以及双极到神经节细胞突触的突触传递。理论上，释放到双极细胞上的谷氨酸会使off -双极细胞去极化，同时使on -双极细胞(OBCs)超极化。可以想象的是，如果在RP患者缺失的光感受器末端放置谷氨酸释放假体，与剩余的双极细胞树突的通信可以将视觉信号传播到神经节细胞。最近提出了几种释放谷氨酸的假体设计;一种是使用光波导锁锁视网膜神经元附近的神经递质[65]，另一种是使用微流体神经递质通过微型孔释放[66]，[67]。Pepperberg小组提出使用栓系神经递质进行刺激[68]。然而，目前还不清楚这些设备是如何吸引视网膜神经元的树突并补充释放的神经递质的。
使用光遗传刺激的视网膜假体:
光遗传学是一种较新的假体刺激技术，它依靠病毒表达(转导)盲人视网膜神经元中的光敏离子通道，使这些神经元随后被光激发。这种分子技术有潜力改善细胞靶向性，增加空间分辨率，并提供更好的光刺激与细胞激发的耦合。光遗传学起源于1865年费迪南德·科恩(Ferdinand Cohn)[69]的一项观察，该观察发现某些单细胞藻类对蓝光有趋光性，但对红光没有趋光性。Mast(1916)将这种藻类的光行为定位在一个橙色眼点上[70](图6)。Sineshchekov[71][72]的吸电极记录显示，光迅速激活藻类膜中的电流(亚毫秒潜伏期)，其动力学比视紫红质更快。Hegemann和Nagel的团队在Xenopus卵母细胞中表达了这些藻膜蛋白，并发现其中一种作为直接光激活的混合阳离子通道[73]，他们将其命名为“通道视紫红质”2 (ChR)。Boyden和diesserth在哺乳动物神经元中表达了ChR 2蛋白，并发现它们能够通过单次蓝光脉冲激发动作电位[74]。
图6所示。在四棱藻类淡水藻中诱导光的眼点视蛋白色素(箭头)的位置。右侧可见鞭毛附着。来自康涅狄格学院藻类分类数据库。
考虑到RP涉及大量的基因突变，光遗传学等非疾病基因治疗可以使许多盲人患者受益。目前，各种光遗传蛋白刺激技术正在评估用于调节神经元的技术，包括光激活的离子通道、离子泵(如菌视紫红质、盐视紫红质)和g蛋白(如黑视色素、视紫红质)。光遗传蛋白都在其蛋白质侧链的结合口袋中包含维生素a /视网膜类似物(全反式14-视网膜或13-视网膜)[75]。其他正在研究的光激活蛋白包括:n -乙基马来酰亚胺修饰谷氨酸通道(LiGluR)[76])、腺苷酰/鸟苷酰环化酶[77]、磷酸二酯酶[78]和红外光门控g蛋白(如蛇TrpA1)(通常称为热遗传)[79]。然而，目前还不清楚这些机制是否具有激活视网膜网络所需的快速动力学和更高的定量灵敏度。
目前开发的所有光遗传蛋白都只在神经元膜上表达光蛋白，这与视网膜光感受器相比严重减少了量子捕获。例如，一个中央凹锥体光感受器包含1000-1200个充满光紫红素的膜嵌层，这将它们的量子捕获放大了约1000倍[80][81]，在视紫红素棒中发现了类似数量的充满视紫红素的圆盘[82]。因此，通常需要强光源提供足够的高照射度(>1015-17quanta/cm2/sec)来充分激活膜中的ChRs，使视网膜神经节细胞去极化到动作电位阈值[83]，[84]，[85]。由于在办公环境中很少遇到这些辐照水平，大多数光遗传假体被认为是依赖相机和人工光源(如投影眼镜)提供高通量视网膜激活、光适应和场景对比度增强的组合产品技术(如图2)。光刺激编码器范式的研究也在进展中，用于为ChR治疗提供有效的光刺激，以激活天然视网膜网络功能(如Yan和Nirenberg[86])。
图7所示。ChR2介导视网膜神经元的光遗传转导。A: AAV启动子结构，使用巨细胞病毒-肌动蛋白(CAG)启动子和绿色荧光蛋白标签(GFP)转导视网膜神经元。大鼠视网膜中通道视紫红质II结构的转导模式。B: AAV CHr2主要转导于包括神经节细胞在内的视网膜内神经元。C:同一视网膜的组织学。、神经节细胞层(GCL)、内丛状层(IPL)、内核层(INL)、外核层(ONL)。Bi等人，2006年(细胞出版社/Elsevier授权)。
光基因治疗的光激活去极化通道:
Bi等人(2006)[83]首次将ChR 2病毒转导到盲rd1小鼠和大鼠视网膜内神经元中。他们使用一个腺相关病毒(AAV)载体构建偶联到一个强大的非选择性启动子来表达ChR2 GFP标签构建(图7)。将AAV2构建注入玻璃体，转导了许多小鼠和大鼠视网膜神经节细胞和一些视网膜内部神经元。蓝光刺激引起转导的视网膜神经节细胞去极化并产生动作电位，可作为视觉诱发电位(VEPs)进行监测。目前，ChR2疗法的早期可行性临床试验已于2015年8月在美国开始，最近有报道称(2017年11月17日)，一些患者可以感知房间窗户的位置[87]。被称为“ReaChR”或“Chrimsons”的红移ChRs也被用于灵长类动物和人类视网膜的失明适应症，也使用了非选择性CAG启动子[88]。最近(2017)一项针对色素性视网膜炎患者的欧盟临床试验使用了光遗传组合产品“ChrimsonR”ChR和仿生“视觉界面刺激眼镜”(NCT03326336 Clinicaltrials.gov)。
像ChR2一样，OBCs通常产生一个持续的去极化中心光刺激。在啮齿类动物中，可以使用Grm6启动子对这些细胞进行基因靶向[89]。Lagali等人(2008)使用体内电穿孔法在rd1盲小鼠新生鼠的眼睛中转染带有ChR2慢病毒基因构建的OBCs[84]。转染的小鼠对高达0.26℃/度的移动光栅有可测量的视动反应。通过神经节细胞对蓝光刺激放电测量的双极细胞反应阈值为~3x1015量子/平方厘米/秒。Doroudchi等人(2011)使用AAV Grm6 ChR2结构在一系列盲小鼠系(rd1, rd10, rd16)中转导OBCs[85]。他们发现，ChR2的表达可以稳定达一年，并发现神经节细胞对蓝光的放电阈值~4 × 1016量子/平方厘米/秒。在莫里斯水迷宫测试中，经过转导的盲鼠能够分辨出被蓝光照亮的逃生平台[90]。
光基因治疗的光激活超极化通道:
光遗传超偏振光机制也用于模拟光感受器和OFF-center双极细胞的光响应，这些细胞通常对光超偏振光。已经发现了几种产生超极化的泵和通道:(1)卤色紫红质，一种黄色光激活的氯离子泵使细胞超极化;(2) Chief或菌视紫红质等质子泵的光激活使酸敏感离子通道打开，使细胞超极化[91]，[92]，[93]。(3)最近发现了一个真正的光门控氯离子通道家族，具有更高的光灵敏度和绿色位移激活光谱(GtACR1) [94];(4)氯化物ChR, IC++已开发[95]。Pan组用halorhodopsin和ChR2的病毒组合构建转导rd1盲小鼠的视网膜内神经元，对神经元进行双蓝光兴奋性和黄光抑制性离子通道控制[96]。
退化锥体在一些盲鼠品系中已经被发现存活。因为与光感受器的光诱发的超极化相似，氟菌紫质的激活会使神经元超极化，所以氟菌紫质的第二个应用是恢复退化锥体光感受器的光响应。(参见Marc一章)。Busskamp等人(2010)使用氟菌紫质EYFP结构和锥体特异性启动子在两种盲小鼠菌株中转导表达[97]。黄光刺激导致转导的视锥细胞超极化并激活视网膜网络。在氟菌紫红质转导的锥体视网膜上，ON和off中心视网膜神经节细胞的光反应均可记录在1014量子/平方厘米/秒的阈值。最近有报道称，灵长类动物和人类中心凹锥体的锥体特异性启动子转导得到了改进[98]。
光基因治疗的光激活g蛋白门控机制:
g蛋白门控视蛋白用于视网膜假体，如杆状视紫红质或黑视蛋白，采用了能量有利的生化扩增机制，与直接光门控离子通道ChR相比，显著提高了它们的光灵敏度。Kim等人(2005)的早期研究表明，光激活视紫红质的g蛋白嵌合体可与肾上腺素能受体偶联[99]，而Qiu等人(2005)则表明，转染黑视素可导致光使培养中的肾细胞去极化[100]。Lin等人于2008年首次在视网膜上应用AAV巨细胞病毒(CMV)启动子-黑视素构建物在rd1盲小鼠中转导视网膜神经节细胞[101]。经过转导的盲鼠现在能够在两个通道的水迷宫测试中探测到光。
目前on -中心双极细胞(OBC)是光遗传g蛋白门控失明治疗的活跃靶区，这是由于on -中心旁凹棒和凹锥双极细胞的丰富，以及它们的on -反应依赖于g蛋白激活TrpM1阳离子通道[102]。最近，一些研究小组发现OBCs中黑视素(Gq g蛋白)或视紫红质(Gt)的转导可以混杂激活mGluR6代谢受体(Gq) g蛋白。这一外来机制逆转了通常开放的TrpM1兴奋通道对光的闭合，导致OBC中的TrpM1通道产生与正常相反的光响应。Van Wyk等人(2015)使用AAV-Grm6黑视素- mglur6嵌合体构建“optical - mglur6”激活Rd1盲小鼠OBCs中的trpm1门控兴奋性离子通道[103]。在光- mglur6 Rd1盲小鼠中，神经节细胞激活的光阈值比Rd1 ChR2转导的同胎小鼠低约1000倍，同时出现了光- on和OFF-视网膜网络反应(图8)。Gaub等人(2015)和cehaji - kapetanovic等人(2015)在使用AAV2-Grm6视紫红质结构的Rd1盲小鼠中发现了类似的光敏感度增加，当看到猫头鹰俯冲的电影时，Rd1盲小鼠在奔跑距离上表现出了行为上的增加[104,105]。
图8所示。黑视素嵌合体AAV的转导模式和对光敏感性在盲小鼠模型上的作用。答:rd1小鼠视网膜中杆状双极细胞的Opto- Grm6 AAV转导模式。绿色为抗胆碱乙酰转移酶，红色为抗黑视素，DAPI核染色，蓝色。(刻度柱20um) B:光刺激导致细胞外记录的神经节细胞中黑视素介导的放电增加，该细胞不被APB阻断(蓝条表示光的起始/偏移)。C:黑视蛋白嵌合体转导的盲小鼠与ChR2转导的光诱发神经节细胞放电阈值的比较。AAV黑视素，(蓝色)，黑视素转基因，(黑色)，ChR2(红色)g蛋白门控视素结构对光明显更敏感。参考文献[103]，经公共科学图书馆许可。
光基因疗法的表现:
光基因刺激疗法的优势在于能够以接近细胞分辨率的光敏刺激传递到大的视网膜区域，并更好地与盲人患者视网膜假体中的神经元进行空间耦合。然而，将病毒衣壳注入灵长类动物的中央视网膜，揭示了视网膜神经元转导过程中一些未预见到的问题，尤其是在人类正常视力中至关重要的中央凹。中心凹双极和神经节细胞体与中心的锥光感受器输入相距约2度[5,21]。在盲人患者中，当被光激活时，ChRs的病毒转导进入周围的双极和神经节细胞体，可能会引起磷光烯，而磷光烯似乎起源于它们的中央锥细胞。
最后，灵长类动物视网膜有一系列的膜屏障，目前阻碍病毒转导，特别是玻璃体内注射病毒结构，这是晚期RP患者的首选方法。与小鼠模型相比，一些AAV衣壳结构的转导在灵长类动物中的有效性可能降低[106]，[107]。也可能存在对病毒衣壳和或荧光蛋白标记的适度宿主免疫反应，如[108]，[109]。ILM/Muller胶质细胞尾足在病毒转导过程中起着复杂的作用，首先是阻止AAV病毒蛋白扩散到视网膜，同时也为进入视网膜的病毒提供结合位点。在灵长类动物中，ILM似乎在靠近黄veve附近和视网膜周边最薄[110]。ILM是由几种细胞外基质蛋白(层粘连蛋白、agin、perlecan、nidogen、胶原蛋白)、核酸酶和几种硫酸肝素蛋白多糖[111][112]组成的基膜。
Yin等人(2011,2014)和Ivanova等人(2010)都在灵长类动物的眼睛中玻璃体内注射了含有肌动蛋白启动子的aav2 -基因- gfp结构，发现神经节细胞体的病毒转导主要局限于以中心凹为中心2度的一个细环状区域，即ILM最细的地方，以及周围视网膜的一些孤立斑点。图9[113][22,114](另见[106])。针对灵长类动物双极细胞的玻璃体内注射结构物也有类似的环形中心凹转导模式[107]。为了减少旧世界灵长类动物眼睛中ILM AAV的扩散障碍，注射玻璃体溶解酶、玻璃体切除手术，包括或不包括内限制膜剥离(见[113]、[115]、[116])，然而，这些治疗也可能减少AAV的构建附着。这导致其他人主张有限的视网膜下注射(<100 μ L) AAV结构[117]，[118]，然而这些注射这些可能不适合患有晚期视网膜疾病的RP患者[106]。然而，即使是有效的中央凹旁视网膜光遗传转导也可以为严重失明患者提供显著的视觉益处。
图9所示。灵长类动物眼睛玻璃体内注射AAV衣壳的病毒转导模式。A.荧光素血管造影显示B处荧光图像的视网膜位置。aav2 / 2hcx -GFP标记结构的转导只发生在视网膜内神经元，特别是神经节细胞。环状转导模式被观察到，因为黄凹周围的ILM较薄，允许更好的衣壳进入(Connexin 36 (hCx)，来自Yin等人。2011 IOVS[113](获得许可)。
退化RP视网膜的基因表达模式可能与正常视网膜不同，导致AAV治疗无效。RP患者经历长期的逐渐的视力丧失，可能需要很多年，不像大多数失明的啮齿动物模型。(参见网络视觉部分视网膜退化)。虽然RP传统上被认为是一种导致光感受器丧失的疾病，但这些视网膜变性也会影响视网膜重塑和许多视网膜内神经元的突触重组[119]，[120]。失活基因DNA可甲基化[121]，[122][123]，在退化视网膜中可导致细胞内基因失活/降解;降低AAV启动子转导效率，或导致脱靶细胞基因表达[124][103]。AAV治疗OBC尤其如此，在培养的人类视网膜外植体中，4XGrm6启动子结构的转导与OBC不特异性[124]。在转导人类视网膜时可能需要更特异性的OBC启动子[107]。这些启动子的表达模式如何在退化的人类RP患者的OBCs中改变目前还不清楚，可能只有通过临床试验才能揭示。
表二:使用光遗传联合疗法的视网膜植入物。在人体临床试验中测试的产品以粗体显示。
视网膜假体刺激安全:
图10所示。光学相干断层成像(OCT)在光学透明刺激电极下实时成像视网膜损伤的实例。上图:视网膜过刺激(50Hz 749µC/cm2/ph) 5 min的OCT延时电影，使用盐水填充的透明视网膜前电极。B:成像后刺激区下的组织学分析显示ILM(箭头)、IPL(箭头)局部肿胀，视网膜脱离。C: ILM Muller细胞端足(箭头)和固缩神经节细胞肿胀的细节(参考文献[125]，IOP出版许可)。
在日常生活中使用视网膜假体的患者将视网膜组织暴露在慢性刺激条件下。视网膜组织所能安全耐受的电流和光的数量是有限的。已经开发了多种方法来评估刺激电极下的视网膜，并通过使用眼底镜、荧光、光学透明刺激电极和/或光学相干断层扫描(如[126]，[125,127])研究视网膜功能。过度的电刺激可引起视网膜神经元和神经胶质细胞的电穿孔。视网膜前表面附近的过度刺激可导致排列在ILM的Muller细胞端足肿胀和神经节细胞死亡(图10)([125])。然而，视网膜的慢性电刺激损伤限度(小时)定义不太明确，可能与位置有关，并对组织邻近性敏感(见[128]，[127]，[129]，[126])。
对于使用光刺激刺激视网膜神经元的假体，已有标准限制正常视力患者的视网膜暴露在过量紫外线和蓝光下。RP患者常抱怨对过度光和眩光敏感，而RP动物模型的视网膜对长时间眼底光照的光损伤非常敏感[130]。许多早期的基于ChR的光遗传疗法依赖于通过相机-投影仪眼镜产生的高视网膜短波通量光，以提供足够的ChR通道激活转导的视网膜神经元。然而，新的ChRs和g蛋白视蛋白已被开发出来，其灵敏度转移到更长的波长和更高的光灵敏度(如图8C)。
光会在热化学和光化学上损伤视网膜层。健康视网膜在不同波长下的安全照度标准基于Ham[131,132]的灵长类动物眼睛暴露数据，以及Noell在大鼠[133]的早期研究。这些研究和其他研究已经被改编为一系列眼科设备的国际标准(ANSI Z80.36, ISO15004, ISO 60825, Rp27.1)。这些光安全性研究大多依赖于光感受器诱导的光损伤作为损伤终点[134,135]。目前尚不清楚终末期RP动物模型和患者中剩余的视网膜神经元能安全地耐受多少光，这些神经元的光感受器和色素上皮细胞已经退化。
简介:
使用电和光基因刺激的视网膜假体疗法有了令人兴奋的新进展，有可能为严重视力受损的人提供更好的形式视觉和改善生活质量。在将生物技术整合到失明患者退化的视网膜上，每种技术都带来了不同的挑战和好处。耦合和替换中央凹丢失的视网膜神经元仍然是电子和光基因联合治疗的挑战。在现实世界评估这些新医疗技术对患者视力的影响时，有许多共同的问题。鉴于RP作为一种疾病的异质性，多种疗法的可用性可能对患者有用，每种疗法对其视网膜变性类型及其进展程度都有不同的优势。
免责声明:本文所表达的观点和/或结论仅为作者个人观点，绝不暗示食品和药物管理局的政策或立场。提及商业产品、它们的来源或它们在与本报告所报告的材料相关的用途，不应被解释为卫生与公众服务部对此类产品的实际或暗示认可。
伊森·d·科恩博士
生物医学物理系，
科学与工程实验室办公室，
仪器与放射卫生中心，
白橡树联邦研究中心。马里兰州银泉，20993。
电子邮件:ethan.cohen@fda.hhs.gov。
致谢:我们感谢Bruce Drum, Sunder Rajan，和Ksenia Blinova的批判性手稿评论。
关于作者
Cohen博士于1987年在宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)的Peter Sterling博士的视网膜实验室获得博士学位。在明尼苏达大学接受Robert Miller博士的生理学博士后培训后，在UCLA Jules Stein眼科研究所接受Gordon Fain博士的培训后，他加入了该系的教员。1992年在耶鲁大学医学院担任视网膜神经生理学博士。2000年，他与约翰·道林(John Dowling)一起，成为哈佛大学分子与细胞生物学系的客座教授。自2003年以来，他是FDA设备和放射健康中心科学和工程实验室办公室的研究科学家。他的研究兴趣包括设计评估视觉神经刺激装置的安全性和有效性的新方法，以及改进神经毒性药物的检测。
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